在生命科学领域，生物分子通过液-液相分离形成的凝聚体对细胞功能至关重要，其动态的液-固态相变调控着一系列生化活动。然而德益配资，如何构建具有可控、可逆相变能力的人工凝聚体，以模拟这种精巧的自然机制并用于生物医药应用，尤其是实现静脉给药过程中的稳定递送和靶点释放，一直是该领域面临的关键挑战。
近日，同济大学杜建忠教授、范震教授、孙敏博士团队报道了一种氧化还原调控的、具有抗降解能力的相变肽液滴。该体系可通过匹配体内微环境，利用氧化还原反应精准控制肽凝聚体在液体与固体状态之间的可逆循环切换，并成功应用于静脉递送siRNA，在模型中显示出显著的肿瘤抑制效果。这一成果为操控生物分子相分离以递送生物药物开辟了新前沿。相关论文以“Redox-Regulated Phase Switchable Peptide Droplets with Degradation Resistance for Intravenous Delivery of Biopharmaceuticals”为题，发表在
Advanced Materials上。
研究团队首先设计并合成了基于“粘性位点-间隔基”策略的模型肽YHssHY。通过系统地研究肽浓度、盐浓度、pH和温度等参数，团队绘制了其液-液相分离相图。研究显示，在酸性条件及适宜的盐浓度下，YHssHY能够自组装形成无膜的液态液滴。这些液滴展现出典型的相分离特征，如成核、生长和液滴融合。分子动力学模拟揭示了其中的分子作用机制：酪氨酸和组氨酸作为“粘性位点”通过π-π堆积和氢键驱动相分离，而二硫键作为“间隔基”增强了肽链的柔性，促进了分子间相互作用，从而更易形成凝聚体。
图1 | 肽自组装形成氧化还原调控的相变凝聚体示意图。 肽YHssHY在碱性水溶液中保持可溶单体状态（左）。随着pH降低，肽分子自组装启动，通过增强的分子间相互作用形成无膜的液态液滴（中）。随后，在辣根过氧化物酶催化下，液态肽凝聚体逐渐被氧化，形成固态的半透性凝聚体囊泡。当遇到还原性微环境（如富含谷胱甘肽的组织）时，这些固态囊泡会恢复为液态液滴。此外，在各种生理条件下，这种相变可以是可逆和循环的（右）。
图2 | 通过液-液相分离形成肽凝聚体。 a) YHssHY在不同肽浓度和盐浓度下的相图（pH 6）。实心点表示存在大量凝聚体（浊度>0.2）德益配资，阴影点表示存在少量凝聚体（浊度0.14-0.2），空心点表示无明显凝聚体（浊度<0.14）。b) YHssHY在不同pH和肽浓度下的相图（50 mM NaCl溶液）。比例尺：10 μm。c) pH 6条件下，YHssHY凝聚体浊度随温度的变化。d) YHssHY在形成凝聚体过程中的延时图像（浓度1.0 mg/mL）。观察到明显的成核和生长现象，右上角为放大视图。比例尺：20 μm。e) 显示YHssHY液滴之间融合的延时图像。比例尺：5 μm。f) YH和YHssHY组装体内分子相互作用的全原子分子动力学模拟。左图：700个肽分子在3个不同时间点的快照。右图：密相内相互作用的放大图，粉色线表示π-π堆积，绿色线表示氢键。肽残基中的原子颜色：氢（白）、氧（红）、碳（灰）、氮（蓝）、硫（橙）。g) 通过等温滴定量热法稀释实验确定的YHssHY与RNA共组装形成凝聚体的焓变。
然而，单纯的液态凝聚体生理稳定性差，难以直接用于静脉递送。受生物氧化过程启发，研究人员利用辣根过氧化物酶催化酪氨酸氧化交联，成功将液态凝聚体转化为固态的、半透性凝聚体囊泡。原子力显微镜测量显示，氧化后囊泡的杨氏模量提高了63倍，显著增强了其机械强度。在模拟血液环境中，未氧化的液态凝聚体迅速溶解，而氧化形成的固态囊泡能保持长期稳定。更重要的是，通过精确调控氧化过程中的碱含量，可将这些固态囊泡的尺寸从微米级调整至纳米级，以满足静脉给药对颗粒尺寸的特定要求，确保其在循环系统中的滞留和肿瘤部位的富集。
图3 | 肽凝聚体的相变。 a, b) 氧化前后凝聚体的稳定性。凝聚体溶液的延时图像(a)及其浊度变化(b)。与未氧化凝聚体相比，氧化凝聚体稳定性显著增强。c) 使用原子力显微镜测得的氧化前后凝聚体的杨氏模量。每个条件测量不少于9个凝聚体。d) 氧化凝聚体在兔血中表现出增强的稳定性（箭头指示凝聚体）。比例尺：10 μm。e) 氧化前后凝聚体的流体动力学直径和形态变化。f) 氧化凝聚体的尺寸稳定性。g-i) 使用藻蓝蛋白和罗丹明B分别代表生物大分子和小分子，评估YHssHY凝聚体的选择性渗透性。凝聚体选择性渗透示意图(g)，罗丹明B分布在整个凝聚体中(h)，而藻蓝蛋白仅观察到在凝聚体表面(i)。j) YHssHY和YHssHY/siRNA氧化凝聚体的共聚焦显微镜图像，两者均显示出明显的“核-壳”结构——刚性的外层“壳”和富含水的内部“核”。k) 标记了罗丹明B的YHssHY氧化凝聚体中心区域的荧光漂白恢复实验。比例尺：2 μm。
该肽凝聚体体系的核心优势在于其氧化还原响应的可逆相变能力。谷胱甘肽作为哺乳动物细胞中主要的还原剂，可切割二硫键，使固态囊泡“软化”并恢复为液态液滴。研究证实，通过循环改变氧化/还原环境，可实现YHssHY凝聚体在“固态”与“液态”之间多次可逆切换。这种相变特性直接影响了其细胞摄取行为。实验发现，固态氧化凝聚体主要通过经典内吞途径进入细胞，并容易被溶酶体捕获；而在还原性肿瘤微环境中，其转变为液态液滴后，则能以不同于传统内吞的方式快速进入细胞，且有效避免了溶酶体陷阱，显著提升了细胞内递送效率。
图4 | 氧化还原调控的肽凝聚体相变。 a) 浊度变化表明YH和YHssHY凝聚体在10 mM GSH还原下的溶解情况。与YH凝聚体相比，YHssHY凝聚体在还原环境下溶解更快、更明显。b) 浊度变化表明YHssHY凝聚体的相变。数据表示为平均值±标准差。c) 浊度变化表明氧化的YHssHY凝聚体在不同浓度GSH还原下的溶解情况。d, e) 在循环氧化和还原环境下，凝聚体形态和流体动力学直径的动态变化，展示了氧化YHssHY凝聚体的可切换相变。每个数据点测量不少于24个凝聚体。比例尺：5 μm。f) SEM图像显示液态YHssHY凝聚体、固态氧化YHssHY凝聚体以及恢复后的液态YHssHY凝聚体的形态，其中氧化凝聚体的尺寸被调控在纳米范围内以便进行SEM成像。
图5 | 无需溶酶体捕获的快速内吞作用。 a–d) 与固态氧化凝聚体被溶酶体捕获相比，液态凝聚体和恢复的液态凝聚体（红色）均未观察到明显的溶酶体共定位。细胞核用Hoechst 33258染色（蓝色），溶酶体用LysoTracker染色（绿色）。比例尺：10 μm。d) 共聚焦图像的皮尔逊相关系数分析。e–g) 液态凝聚体和固态氧化凝聚体的细胞内递送效率与商用Lip 2000的比较。共聚焦荧光图像（左）和ImageJ分析（右）显示液态凝聚体和恢复的液态凝聚体的细胞内递送效率更高。比例尺：20 μm。
基于上述特性，研究团队进一步构建了负载siRNA的相变肽共凝聚体，用于靶向治疗胰腺癌。在体外，液态siRNA-肽共凝聚体展现出更强的癌细胞增殖抑制能力，这归因于其高效的细胞摄取。而为了满足静脉给药所需的体内稳定性，需使用其氧化后的固态形式。在胰腺癌皮下和原位小鼠模型中，静脉注射氧化的siRNA-肽共凝聚体后，其固态结构保证了在血液循环中的稳定性；到达高还原性肿瘤微环境后，相变为液态，促进了siRNA的高效细胞内递送和释放，从而显著抑制了肿瘤生长，并下调了致癌基因KRAS和相关信号通路蛋白的表达。同时，该体系展现了良好的生物相容性和低免疫原性。
图6 | 针对皮下胰腺癌的相变siRNA-肽共凝聚体。 a) 使用胰腺癌小鼠模型评估相变siRNA-肽共凝聚体治疗效率的实验流程示意图。b) PANC-1细胞经siRNA-肽共凝聚体及其氧化形式处理72小时后的细胞活力。与氧化形式相比，siRNA-肽共凝聚体对胰腺癌细胞的抑制效果增强。c) 荧光标记的siRNA、siRNA-肽共凝聚体及其氧化形式在血液循环中的稳定性评估。样品静脉注射后，从小鼠提取血清并分离，检测荧光强度以代表剩余样品量。d) 不同处理组小鼠体重的变化。e) 不同处理14天后小鼠的平均肿瘤重量。f) 不同处理14天后从小鼠体内剥离的肿瘤照片。g) 肿瘤组织的KI-67、p-AKT、H&E和KRAS染色组织学图像，显示细胞凋亡，同时磷酸化AKT水平降低，致癌KRAS表达被抑制。比例尺：100 μm。每组n=6只小鼠。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
图7 | 针对原位胰腺癌的相变siRNA-肽共凝聚体。 a) 使用原位胰腺癌小鼠模型评估相变siRNA-肽共凝聚体治疗效率的实验流程示意图。b) 不同处理组小鼠体重的变化。c) 不同处理14天后小鼠的平均肿瘤重量。d) 不同处理14天后从小鼠体内剥离的肿瘤照片。e) 肿瘤组织的Ki-67、p-AKT和KRAS染色组织学图像，显示细胞凋亡，同时磷酸化AKT水平降低，致癌KRAS表达被抑制。比例尺：100 μm。每组n=4只小鼠。f) 小鼠血液中淋巴细胞、中性粒细胞或总白细胞计数的量化。g) 经不同肽-共凝聚体处理的肿瘤组织的Western blot印迹，显示KRAS表达被沉默。每组n=4只小鼠。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。
这项研究成功通过设计响应微环境的肽序列，实现了肽凝聚体液-固态相变的动态调控与循环切换。这种独特的相变能力使得研究者能够精确操控凝聚体的形态、流动性、机械性能和生理稳定性，以适应复杂的病理微环境，从而实现治疗效益最大化。该研究不仅为胰腺癌等疾病的治疗提供了一种新型的相变药物递送系统，更以其模块化的肽设计，为构建可模拟或适应天然相分离过程、用于研究和干预一系列细胞活动的生物材料提供了通用性思路，具有广阔的医学与药学应用前景。
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